编者按
CAR-T细胞疗法已经在血液恶性肿瘤中显示出令人印象深刻的疗效。但对于实体瘤的治疗，CAR-T细胞疗法目前仍然存在诸多挑战。一个主要障碍是缺乏真正的肿瘤特异性靶抗原，目前的靶抗原主要集中在肿瘤中高表达的肿瘤相关抗原中，特异性不够，容易导致副作用，杀伤正常细胞。另一个很重要的障碍是实体瘤的肿瘤微环境，特别是免疫抑制剂，阻止有效的抗肿瘤免疫应答。免疫抑制性肿瘤微环境包含多种成分，包括物理屏障如致密的细胞外基质；功能失调的上皮细胞；代谢检查点如缺氧；免疫屏障，如免疫抑制细胞因子和免疫抑制性免疫细胞。本文介绍的研究成果有助于克服T细胞免疫疗法中的障碍，为免疫疗法提供真正的肿瘤特异性靶抗原。
图1：群体定量免疫肽组学助力T细胞免疫治疗实验流程
正文
2022年8月，宾夕法尼亚大学细胞免疫治疗中心James L. Riley团队在SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE杂志上发表了题为Quantitative immunopeptidomics reveals a tumor stroma–specific target for T cell therapy的文章。使用基于质谱的定量免疫肽组学的方法，研究1500个左右的肿瘤和正常组织样本，作者发现了一个HLA-A*02:01分型的泛癌表位: COL6A3-FLNV,定位于COL6A3基因的第6个外显子上，在多种实体瘤中均特异高表达而在正常组织中则几乎不表达。天然表达的COL6A3特异TCR只对高拷贝数的COL6A3 pHLAs有活性，这影响抗癌疗效。为了获得更好的治疗效果，作者对COL6A3特异TCRs进行突变改造，最终发现两个突变体a1b4和awb4，能够特异识别低拷贝数的原发性病灶中COL6A3 pHLAs，并且该增强型的TCR突变体具有良好的安全性，没有检测到明显的脱靶效应，使多种实体瘤的T细胞免疫治疗成为可能。
研究结果：
一、群体定量免疫肽组学发现肿瘤特异泛癌抗原表位-COL6A3-FLNV
样品类型:
739个肿瘤组织和673个正常组织；
抗体类型:
HLA-A02特异抗体；
实验方法:
质谱非标定量；
免疫肽筛选标准：
在正常组织中几乎不表达；在多种肿瘤中均可检测到高表达。
结论:
最终筛选得到一条位于COL6A3基因第6外显子上的免疫肽段COL6A3-FLNV，它在28%（210）的肿瘤样本中被检测到，且只在1%（7）的正常组织中检测到，且在多种肿瘤中，如食道癌、乳腺癌、非小细胞和小细胞肺癌中COL6A3-FLNV均呈现出明显的高表达（相对正常组织差异倍数至少高出23倍）(见图2A,D)。
验证:
随后作者使用PRM-MS绝对定量的方法检测233个肿瘤或正常组织中COL6A3-FLNV的绝对拷贝数。结果表明：在134个肿瘤样本中有55个检测到COL6A3-FLNV，其平均拷贝数为228 CpC,最高拷贝数为1928 CpC。而在99个正常组织中，只有6个检测到COL6A3-FLNV，其平均拷贝数为28 CpC，最大拷贝数49 CpC(见图2B)。绝对定量结果证实了通过基于TCR的T细胞免疫疗法靶向COL6A3-FLNV治疗癌症的美好前景。同时转录组学的数据也表明COL6A3第六个外显子确实在肿瘤中特异高表达(见图2C)。结合免疫肽组和转录组学数据，表明COL6A3-FLNV是一个很有前景的免疫治疗的靶标。
图2. 群体定量免疫肽组学发现肿瘤特异泛癌抗原表位-COL6A3-FLNV
二、发现和表征COL6A3-FLNV特异结合的TCRs
作者使用与COL6A3-FLNV:HLA-A*02交联好的beads，分别从8个HLA-A*02-阳性和HLA-A*02-阴性的志愿者的血液中，富集COL6A3-FLNV特异结合的TCRs，最终得到91个特异的TCR序列。为了验证TCR的功能，每个TCR序列在CD8细胞中重新表达，然后与负载COL6A3-FLNV肽段的稳定表达HLA-A*02的K562细胞株进行混合。通过COL6A3-FLNV肽段逐步稀释的方法，作者找到两个高灵敏度的TCR(D10和F9)和一个较低灵敏度的TCR(H3)。接下来作者使用SPR的方法体外验证TCR与COL6A3-FLNV的结合力，发现三者（D10/F9/H3）的结合力分别为16um/60um/100um（见图3B）。作者进一步在体内验证了每个TCR是是否特异识别COL6A3-FLNV，结果表明COL6A3-FLNV与F9,D10有强的结合，而H3只有较弱的作用，与前面的体外SPR实验保持一致。为了验证发现的TCR是否有脱靶效应，作者选取与COL6A3-FLNV相似的肽段进行结合实验，发现D10以及F9均无脱靶效应。
图3：发现和表征COL6A3-FLNV特异的TCRs
三 、高亲和力突变型TCR增强了TCR识别pHLA的能力和一型HLA激活CD4 T细胞的能力
为了选择更高亲和力的TCRs,作者使用酵母表面展示的方法筛选F9 TCR的突变体，最终选择到两个突变体a1b4和awb4，能够特异识别COL6A3-FLNV，并且无脱靶效应，具有很好的安全性（见图4A）。同COL6A3-FLNV的结合力分别为19um和1.6um.
通常认为,TCR结合力在1-5um会同时激活CD8和CD4细胞反应，为了验证两株突变体是否能同时激活CD8和CD4细胞反应，作者将F9 TCR和两株突变株a1b4、awb4分别通过慢病毒载体转入到人的T细胞中。结果表明两株突变株均能同时激活CD8和CD4细胞反应，而F9 TCR只能激活CD8细胞反应（见图4B）。通过进一步的研究发现a1b4、awb4识别COL6A3-FLNV肽段的灵敏度相比F9 TCR分别提高了100倍和10倍，暗示TCR高亲和力突变株可以识别样本中低拷贝数的COL6A3-FLNV从而更早引起抗肿瘤免疫反应。
图4：高亲和力突变体TCR增强了TCR识别pHLA的能力和一型HLA激活CD4 T细胞的能力
四、高亲和力突变株TCR能够识别内源靶肽并且没有脱靶效应
TCR能够识别大量相似的多肽，为了说明高亲和力突变株TCR能够特异识别COL6A3-FLNV。且无脱靶效应。作者做了一系列安全验证实验。首先使用突变的方法，找到COL6A3-FLNV上的那些位点是TCR结合所必须的，结果表明不管是F9-TCR还是突变增强型TCR，基本均只有2-3个氨基酸是TCR结合可有可无的（见图5），这表明了结合的高度特异性。接下来作者使用靶标肽为阴性的各种组织来源的细胞，来进一步验证是否有脱靶效应，结果表明均无发现脱靶效应。最后为了说明高亲和力突变株能够识别内源性靶标肽，作者选取COL6A3-FLNV不同丰度的肿瘤细胞系来进行验证实验，结果表明低至200CpC的靶标肽均能被识别，且进行免疫应答。暗示了高亲和力突变株在T细胞免疫疗法中的潜力。
图5：亲和力增强突变株TCR能够识别内源靶肽并且没有脱靶效应
五、高亲和力突变株TCR具备抗肿瘤的能力
为了说明高亲和力突变株TCR具有抗肿瘤的能力，作者选用小鼠模型进行肿瘤抑制实验。首先将肿瘤细胞皮下注入小鼠，在第八天注入改造过的T细胞，直至29天处理掉（见图6A）。IVIS成像结果表明亲和力增强型突变株TCR能够快速且长效的抑制肿瘤的生长（见图6B-I）。此外作者使用体外细胞因子检测的方法发现，已经治愈的小鼠再次经过抗原刺激，依然能够分泌细胞因子来进行抗肿瘤免疫反应（见图6J-K）。进一步表明了此方法的长效性。
图6：亲和力增强突变株TCR具备抗肿瘤的能力
小结：
首先使用基于质谱的群体定量免疫肽组学的方法，找到实体瘤泛癌靶标抗原COL6A3-FLNV。然后根据靶标肽段，筛选出特异的TCR，并通过点突变的方法筛选到更高亲和力的TCR,然后通过各种安全检测实验验证突变TCR的安全性和脱靶效应，最后通过小鼠模型实验验证突变TCR确实具有抗癌的作用。这为实体瘤的T细胞免疫治疗指明了方向。
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