摘要
肿瘤是严重威胁人类健康和社会发展的重大公共卫生问题之一。针对肿瘤的治疗，外科手术切除仍是最普遍、最理想的策略。目前，外科医师在术中主要通过肉眼观察、超声等方法确定肿瘤边界、残余病灶以及微小转移病灶，然而，这些方式存在手术切缘肿瘤易残留、难以实时发现微小转移灶等问题，导致肿瘤术后复发、转移率高，严重影响病人的预后和远期生存。荧光手术导航的快速发展为解决这一问题提供了新的技术支撑。本文聚焦于荧光手术导航用荧光探针，重点对荧光手术导航系统和各类有机、无机近红外二区荧光分子探针进行系统阐述，分析其临床转化与应用面临的瓶颈问题，探讨可能的解决思路，以期为国内外相关领域的研究提供思路与参考。
关键词：生物医学 荧光手术导航 荧光探针 近红外二区 腹腔镜手术系统 分子影像探针
引言
近年来，肿瘤发病率在全球范围内呈高增长趋势。据统计，2020年全球新发肿瘤病人约1930万例，死亡病人将近1000万例[1]。目前，手术仍是实体肿瘤治疗的首选方案。彻底切除肿瘤对于病人的预后和远期生存至关重要，其中完全切除术后生存率可较部分切除术后生存率提高2～5倍。然而，全球范围内肿瘤切除术后的平均复发率仍高达40%，导致其中约80%的病人死亡[2-3]；高术后复发率的主要原因是手术不彻底导致的肿瘤切缘残留、术中难以发现的微小转移灶或小病灶残留、淋巴结微转移等。在临床诊疗行为中，医生在术前可借助超声成像、计算机X射线断层造影、正电子发射断层成像、核磁共振成像等影像手段进行精准的肿瘤定位和形态确认[4]；但在术中，医生只能通过肉眼观察、触诊、超声检查等方法来确定肿瘤边界、病灶残余及微小转移灶，检查手段非常有限，易导致手术切缘残留或术中漏检微小病灶，从而导致肿瘤术后的复发、转移率较高，严重影响了病人的预后和远期生存。因此，临床上迫切需要发展一种无辐射、高灵敏度、高分辨率、高对比度、可在术中实时确定肿瘤边界并显示重要管道结构以及发现微小转移病灶的技术手段，以在术中实时引导手术的开展。在此背景下，荧光手术导航技术应运而生。
荧光手术导航是指利用外源荧光分子探针的特异性标记肿瘤和重要的解剖结构，在荧光成像系统的指引下，在术中精准定位病灶并实时指引外科医生手术的过程。该技术不仅可以避免重要解剖结构的损伤，还可以清晰地指示肿瘤边界，帮助医生发现肿瘤切缘的少量残存肿瘤细胞以及术前影像难以发现的微小肿瘤病灶，具有实时、高灵敏度、高分辨率、高对比度、无辐射等一系列优点，目前已被广泛应用于前哨淋巴结的指示、肿瘤手术切除、重要神经和管道结构显示等临床领域，成为外科研究的前沿热点[5]。荧光手术导航设备主要包括荧光手术导航系统和荧光分子影像探针两部分，如图1所示。目前，一系列近红外一区(NIR-Ⅰ，700～900 nm)荧光手术导航系统已经获批进入临床，该导航系统包括便携手持式系统、开放手术系统和腹腔镜手术系统[6-9]，在乳腺癌[10-11]、胃癌[12-13]、肝癌[14-15]、宫颈癌[16]等肿瘤手术中被广泛应用。在临床上使用的荧光分子探针主要包括荧光素钠[17]、亚甲基蓝(MB)[18-19]、5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)[20-21]、吲哚菁绿(ICG)[22-24]等，其中ICG的应用最为广泛，已成为目前临床上主要使用的荧光分子探针。然而，目前临床上应用的ICG在NIR-Ⅰ发光，且ICG本身无肿瘤特异靶向能力，存在穿透深度有限、背景信号强、信噪比欠佳、无肿瘤特异性、易产生假阳性等一系列问题。相比于NIR-Ⅰ荧光，近红外二区(NIR-Ⅱ，1000～1700 nm)的荧光波长更长，能明显减少生物组织对光的吸收和散射，且能克服自体荧光的干扰，具有更深的组织穿透深度、更低的背景信号、更高的信噪比和空间分辨率[25-26]。因此，NIR-Ⅱ荧光手术导航成为近年来手术导航领域的前沿研究热点，科研工作者围绕开发NIR-Ⅱ手术导航系统、研制各类新型NIR-Ⅱ荧光分子探针、增加荧光探针的肿瘤靶向能力和靶向特异性等开展了系列工作。本文聚焦NIR-Ⅱ荧光分子探针，围绕其手术导航应用，总结最新的研究进展，分析其临床转化面临的瓶颈问题，探讨可能的解决思路，为国内外相关领域的研究人员提供参考，以期推动NIR-Ⅱ荧光手术导航技术的临床应用。
图 1. 荧光手术导航技术
荧光手术导航系统
表 1. 荧光手术导航系统[27]
图 2. 开放式NIR-Ⅱ荧光手术导航系统[33]
荧光手术导航探针
目前，被批准用于临床的荧光手术导航探针包括荧光素钠、5-ALA、MB、ICG。其中：荧光素钠无肿瘤特异性，正常组织也可以被染色，组织对荧光素钠发射荧光的吸收和散射比较严重，并且组织的自发荧光会降低对比度，显影效果不佳；5-ALA需在术前口服，且会使术后皮肤敏感性增加，费用也较高，在肿瘤侵袭区域易出现假阴性，在水肿区域及炎性组织中易出现假阳性[34]；MB可能会导致心律失常、冠状动脉收缩、心输出量减少、肾血流和肠系膜血流减少以及肺血管压力增加[35]，且用量难以控制。此外，这些荧光探针的激发和发射波长均位于400～700 nm区域，穿透深度有限，只能进行组织表面的成像，以致于荧光素钠、5-ALA、MB在手术导航方面的应用已逐步被临床淘汰。为了获得更深的组织穿透深度、开展更加精准的荧光成像和手术导航，需要使用激发和发射波长更长的近红外荧光探针。目前，荧光手术导航中应用最广泛、研究得最透彻的近红外荧光分子探针是ICG。ICG由日本柯达实验室于1955年首次合成，可被波长为750～810 nm范围的光激发，激发后发射最大波长为830 nm的近红外光，如图3(a)、(b)所示[36]。2009年，Ishizawa等[37]首次通过光动态眼成像系统(PDE)将ICG用于肿瘤成像，并提出了目前公认的肝脏肿瘤的ICG成像机理。在随后的10年内，以ICG为基础的近红外荧光手术导航技术在肿瘤手术领域得到了广泛应用，诸多临床研究也分别在手术彻底性、手术便捷性、无复发生存和总生存等方面证实了其临床价值，这些临床研究包括乳腺癌前哨淋巴结的指示[38]、器官切除后血管重建的显示[39]、脑外科[40]和消化外科手术中肿瘤位置的显示[41]等。然而，NIR-Ⅰ荧光成像依然存在穿透深度低、背景信号高、信噪比差等一系列固有的瓶颈问题。近年来，随着NIR-Ⅱ荧光成像研究的深入和纳米技术的快速发展，一系列NIR-Ⅱ荧光分子探针，包括有机小分子、有机纳米探针和无机纳米探针，陆续被研发并应用于手术导航领域，而且研究人员针对这些荧光分子探针开发了靶向修饰技术或递送技术，以增加其肿瘤特异性。接下来，本文针对不同类型的NIR-Ⅱ荧光分子探针及其手术导航应用进行简要介绍和分析。
图 3.
图 3. 花菁类染料ICG的化学结构式和光谱特性：(a)ICG的化学结构式；(b)ICG 的激发光谱和NIR-Ⅰ发射光谱[36]；(c)ICG的NIR-Ⅱ发射光谱[42]。花菁类染料ICG的NIR-Ⅰ和NIR-Ⅱ活体成像效果[42]：(d)小鼠脑部血管成像；(e)小鼠腿部血管成像。(f)～(h)花菁类染料IR-12N3作为导航探针在小鼠体内成像[43]：(f)腿部淋巴结成像；(g)腰椎淋巴结成像；(h)肿瘤成像
有机NIR-Ⅱ荧光手术导航探针
花菁类小分子荧光探针
1857年，Williams等[44]首次合成了花菁染料及其衍生物。花菁染料具有优异的物理化学及光学性质，如高的摩尔消光系数和荧光量子产率、长的荧光发射波长(最大波长可扩展到NIR-Ⅱ)等特点[45-47]。因此，花菁染料被广泛应用于生物医学中的荧光成像领域。进入21世纪以后，医学和生命科学的快速发展极大地推动了花菁染料的发展，近年来研究人员开发了很多用于医学成像和手术导航的花菁类荧光分子探针[48-49]。
在花菁类染料中，最经典的是美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于临床的ICG。到目前为止，ICG在临床荧光手术导航中的应用是利用其NIR-Ⅰ荧光成像功能。2018年，麻省理工学院Bruns教授课题组[42]发现，尽管ICG的发射光谱在NIR-Ⅰ达到峰值，但是其尾带发射延伸到了NIR-Ⅱ，如图3(c)所示，ICG在NIR-Ⅱ具有较高的光穿透深度和信噪比，在小动物活体上表现出良好的NIR-Ⅱ成像效果，如图3(d)、(e)所示。同年，美国国立卫生研究院陈小元教授课题组对现有的NIR-Ⅰ花菁染料进行了系统分析，结果发现：一些量子产率高、荧光强度大的NIR-Ⅰ花菁染料，如IR-12N3、ICG和IRdye800，在NIR-Ⅱ区域也具有明亮的尾发射，并具有高的量子产率和摩尔消光系数，从而可以用于小鼠腿部淋巴结[如图3(f)所示]、腰椎淋巴结[如图3(g)所示]以及肿瘤[如图3(h)所示]等模型的NIR-Ⅱ实时成像；这些探针在NIR-Ⅱ成像时的穿透深度、分辨率、灵敏度以及信噪比等相比NIR-Ⅰ成像都获得了显著提升。因此，上述这些花菁染料都具有NIR-Ⅱ荧光手术导航的潜力[43]。笔者所在研究团队也于2019年开展了基于ICG的NIR-Ⅱ荧光手术导航的工作，并在ICG NIR-Ⅱ荧光成像的引导下实施了小鼠乳腺癌模型的精准手术导航；结果显示：在ICG NIR-Ⅱ荧光手术导航的引导下，能够在术中实时发现肉眼难以发现的微小转移灶和手术切缘的微小残留，可以显著提升手术切除的精准度和彻底性，如图4(a)所示[50]。2020年，田捷教授团队[33]首次完成了ICG NIR-Ⅱ荧光成像引导的肝癌手术切除的人体试验，在临床上证实了该技术可以术中检测到其他医学成像未能检测到的微小肝癌病灶和转移灶，能明显改善手术对肿瘤切除的效果，如图4(b)、(c)所示。
图 4.
图 4. ICG用于NIR-Ⅱ荧光手术导航：(a)在小鼠乳腺癌模型中，ICG用于NIR-Ⅱ荧光手术导航引导下的肿瘤切除[50]；在人体试验中，(b)ICG NIR-Ⅱ成像的信噪比高于NIR-Ⅰ成像，(c)ICG 用于NIR-Ⅱ荧光手术导航下的肝癌切除[33]。具有荧光手术导航潜力的NIR-Ⅱ花菁类有机小分子探针用于NIR-Ⅱ成像：(d) FD-1080在不同激发下的成像效果对比[51]；(e)花菁染料Flav衍生物的NIR-Ⅱ成像[52]
虽然现有的这些花菁类探针在NIR-Ⅱ的尾带发射也具有良好的成像效果，但其荧光量子产率和穿透深度仍有待提高。为解决这一问题，复旦大学张凡教授团队[51]合成了一种具有NIR-Ⅱ激发和发射的花菁荧光探针FD-1080；该探针在加热下能迅速进入胎牛血清(FBS)的疏水空腔内形成蛋白-染料复合物，使得染料单体比例增多和分子刚性结构增大，从而导致其荧光量子产率显著提高到5.94%；在1064 nm激光激发下，该复合物在1080 nm处具有很强的荧光发射特性，能实现小鼠下肢的高分辨成像，如图4(d)所示。加利福尼亚大学Sletten教授团队[52]通过对吸收和发射带较窄的花菁染料Flav进行结构改造，合成出11个含有不同取代基的花菁探针；他们从11个化合物中筛选出两个性能最好的探针，将其分别匹配980 nm和1064 nm激发波长，结合临床已批准使用的ICG，实现了实时、三色的高时空分辨NIR-Ⅱ成像，如图4(e)所示。这些花菁类探针的开发为NIR-Ⅱ荧光手术导航分子探针提供了更多选择，未来必将成为手术导航技术临床转化的强大推动力。
给体-受体(D-A)型有机小分子荧光探针
在分子设计中，引入电子供体(D)和受体(A)是调整π共轭有机化合物电子结构的有效手段。当在小分子荧光探针中引入D和A后，其能隙会降低，荧光激发和发射光谱也会相应地发生红移。因此，D-A型NIR-Ⅱ荧光有机小分子也被广泛探索。中国科学院长春应用化学研究所王植源教授课题组[53]通过使用强电子受体——苯并双(1，2，5-噻二唑)及其衍生物，制备了一系列D-π-A-π-D型小分子，如图5(a)所示，这些小分子在NIR-Ⅱ表现出了非常强的荧光发射，如图5(b)所示。2016年，斯坦福大学戴宏杰教授团队[54]报道了一种以苯并双噻二唑(BBTD)作为电子受体(A)、以三苯胺作为电子给体(D)，组成D-A-D分子骨架的NIR-Ⅱ小分子荧光探针CH1055，并将其用于脑胶质瘤成像，如图5(c)所示，但该荧光探针的荧光量子产率很低(仅为0.2%)。为了达到临床应用的目的，需开发一些高荧光量子产率的D-A型NIR-Ⅱ荧光探针。戴宏杰教授团队与南方科技大学梁永晔教授课题组[55]合作，以2，6-烷氧基链取代的苯作为电子屏蔽单元，以3，4-乙烯二氧噻吩(EDOT)作为电子给体单元，用于提高荧光分子在水溶液中的量子产率；并基于上述设计开发出了荧光探针IR-E1，其荧光发射波长在900～1400 nm之间，该荧光探针在水溶液中的量子产率可以达到0.7%，并被成功应用于小鼠脑震荡模型的NIR-Ⅱ活体荧光成像。然而，这些用于活体成像的苯并双噻二唑衍生物探针的激发和发射波长通常分别位于约800 nm和1000 nm处，波长仍然较短。中国科学院化学研究所马会民教授课题组[56]用Se原子替代苯并双噻二唑中的S，制备出了一种发射波长超过1200 nm且可用于活体成像的小分子光学探针FM1210；FM1210的长波长发射使其能以100 frame/s的帧率对小鼠进行高速NIR-Ⅱ活体荧光成像，如图5(d)所示。这些NIR-Ⅱ荧光分子探针优异的成像性能，为其应用于NIR-Ⅱ荧光手术导航奠定了良好的基础。
图 5.
图 5. 具有荧光手术导航潜力的D-A型有机小分子探针。(a)～(b)D-π-A-π-D型有机小分子及其荧光发射光谱[53]；(c)有机小分子探针CH1055在脑胶质瘤模型中的NIR-Ⅱ荧光成像[54]；(d)有机小分子探针FM1210在小鼠NIR-Ⅱ活体荧光成像中的效果[56]
有机聚合物纳米探针
有机共轭聚合物由C—C和CC交替连接而成，有三个或三个以上互相平行的P轨道，从而形成了独特的π电子共轭结构，显著缩小了成键和反键能带间的能隙，为载流子和自由电子提供了离域迁移的条件，加之电子或能量可以自由地在共轭骨架上移动，因此，有机共轭聚合物具有半导体性质和特殊的光学性能[57-60]。由共轭聚合物制成的纳米尺寸的聚合物纳米颗粒具有光谱可调、良好的光稳定性、荧光强度高、生物安全性高和表面易功能化等众多优点，因此在生物医学成像和手术导航领域具有广阔的应用前景。近年来，研究人员合成了一系列具有良好NIR-Ⅱ荧光成像效果的有机聚合物纳米探针。2014年，斯坦福大学戴宏杰教授课题组[61]合成了一种荧光聚合物(pDA)，并利用磷脂-聚乙二醇对该聚合进行纳米组装，得到了生物相容的pDA-PEG纳米探针；该纳米探针的最大发射峰在1047 nm处，位于NIR-Ⅱ生物窗口；该聚合物纳米探针高的量子产率(1.7%)使其可以以25 frame/s的速率对小鼠动脉血流、深层组织等进行超快NIR-Ⅱ荧光成像。2019年，中南大学邹应萍教授课题组[62]以苯并二噻吩(BDT)作为供体、以三唑[4，5-g]喹喔啉(TQ)作为受体，合成了三种类型的聚合物(P1、P2和P3)，如图6(a)所示，并将其组装成聚合物纳米探针(P1-Pdot、P2-Pdot和P3-Pdot)，这些聚合物纳米探针展示出了NIR-Ⅱ荧光发射性能，如图6(b)所示；随后，他们将P1-Pdot应用于小鼠血管[如图6(c)所示]和荷瘤小鼠肿瘤的NIR-Ⅱ成像，成像结果都表现出高的信噪比。2020年，南京工业大学黄维院士团队[63]开发了一种新型的共轭聚合物纳米探针L1057，并通过显微成像和宏观成像的方式验证了L057的活体NIR-Ⅱ荧光成像能力：在脑血管的显微成像中，1.9 μm的脑血管也能够被清晰成像，且具有较高的信噪比；对开颅鼠进行脑血管成像，最大探测深度高达900 μm；在小鼠全身血管的成像中，可以清晰地观察到直径约200 μm的血管。此外，L1057对小鼠的微小肿瘤也展示出了良好的成像效果，如图6(d)所示。上述这些有机聚合物纳米探针优异的NIR-Ⅱ荧光成像效果，为其应用于手术导航奠定了基础，未来有望成为NIR-Ⅱ荧光手术导航的新型分子探针。
图 6.
图 6. 聚合物纳米探针用于NIR-Ⅱ荧光成像。(a)NIR-Ⅱ聚合物P1、P2、P3的结构[62]；(b)聚合物P1、P2、P3组装的纳米探针P1-Pdots、P2-Pdots、P3-Pdots的荧光发射光谱[62]；(c)P1-Pdots对小鼠血管的NIR-Ⅱ荧光成像[62]；(d)LNIR-Ⅱ聚合物纳米探针L1057对肿瘤的NIR-Ⅱ荧光成像[63]
AIE荧光纳米探针
用于生物成像、检测与治疗的有机发光材料的应用环境都是水溶液，而现有的大部分荧光探针在聚集态时会由于分子间π-π相互作用的增强而出现荧光强度大幅降低的现象，即存在聚集猝灭现象，从而极大地限制了这些探针在生物分子检测、成像和标记中的应用。2001 年，唐本忠院士团队[64]发现了与聚集猝灭完全相反的聚集诱导发光(AIE)现象：一些分子在聚集或者固态时，其荧光强度显著高于其在溶液中的发光强度。AIE有机荧光探针具有光稳定性好、信噪比高、生物相容性好等优点，在生物医学成像及手术导航中展现出了巨大的应用潜力[65-68]。
近年来，研究人员开发了一系列用于NIR-Ⅱ荧光成像的AIE荧光纳米探针。2018年，中国科学院深圳先进技术研究院郑海荣研究员团队[69]与新加坡国立大学刘斌教授团队合作，构建了NIR-Ⅱ(1000～1700 nm)AIE分子，通过纳米共沉淀技术制备了RGD多肽靶向修饰的AIE探针TB1-RGD，并用该探针实现了脑胶质瘤的NIR-Ⅱ荧光成像。南方科技大学李凯教授课题组[70]开发了一种由疏水性供体-受体-供体(D-A-D)核心和亲水性聚乙二醇(PEG)链构成的两亲性聚集诱导发光分子组装的纳米探针(SA-TTB-PEG1000)，该探针具有超过1000 nm的最大发射峰和超过10%的荧光量子产率，在小鼠和新西兰兔模型上实现了穿透深度约为1 cm、在体分辨率约为38 μm的多尺度NIR-Ⅱ荧光成像，如图7(a)、(b)所示。此外，李凯教授团队[71]合成了基于TTB分子的NIR-Ⅱ AIE纳米探针，并在灵长类动物体内成功实现了深度高达1.5 cm的血管成像，突破了当前NIR-Ⅱ荧光成像深度在毫米级别的限制。2021年，浙江大学钱骏教授团队[72]提出了长脂链生物可排泄AIE探针设计思路，并将该AIE探针成功应用于非人灵长类动物NIR-Ⅱ穿颅脑血管荧光成像及NIR-Ⅱb区肠胃道荧光造影，如图7(c)、(d)所示。上述AIE纳米探针展示出了良好NIR-Ⅱ荧光成像效果，为手术导航探针提供了更多选择。然而，如何系统地评价这些聚合物纳米探针的生物安全性，推动其临床转化，仍是目前面临的瓶颈问题之一。
图 7
图 7. AIE荧光纳米探针的应用。AIE荧光纳米探针SA-TTB-PEG1000用于小鼠(a)和新西兰兔(b)的多尺度NIR-Ⅱ荧光成像的效果[70]；AIE纳米探针OTPA-BBT 用于非人灵长类动物NIR-Ⅱ穿颅脑血管荧光成像的效果(c)以及用于近红NIR-Ⅱb区肠胃道荧光造影的效果(d)[72]
无机荧光纳米探针
无机量子点
量子点是一种球形或类球形的半导体纳米晶材料，其三维尺寸均小于该半导体材料的激子玻尔直径，一般在2～10 nm之间。这类半导体纳米晶可将其电子和空穴限制在三维空间内，这一特性与自然界中的原子或分子类似，因此被称为量子点。量子点材料在特殊波长光的激发下会发出特定波长的荧光，且量子点的吸收光谱、激发光谱和荧光光谱都会随着该半导体纳米晶尺寸以及组成的变化而变化。因此，通过调节量子点的尺寸可以实现对其吸收光谱、激发光谱和荧光发射光谱的精准调节，使其在荧光成像和手术导航等领域有着广阔的应用前景[73-75]。NIR-Ⅱ荧光量子点具有更长的发射波长，其散射强度与波长的四次方呈反比，因而可以穿透更深的皮肤和血液等生物组织，获得更高的成像分辨率，这使得其在荧光成像和手术导航的应用上具有独特优势。近年来，NIR-Ⅱ荧光量子点已被广泛开发和应用。
中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所王强斌教授团队[76-79]对近红外区荧光量子点的活体成像开展了系列研究，首次报道了Ag2S量子点在近红外区的荧光性质，并将其应用于近红外区活体荧光成像，在小动物活体水平上获得了高组织穿透深度(>1.5 cm)、高时间分辨率(约30 ms)和高空间分辨率(约25 μm)的原位、实时成像。同时，他们还将Ag2S量子点分别应用于脑胶质瘤[如图8(a)所示][77]和乳腺癌转移瘤[如图8(b)～(d)所示][80]的NIR-Ⅱ荧光手术导航，显著提高了手术切除的精准度和彻底性。中国科学院福建物质结构研究所陈学元教授团队[81]开发了一种新型NIR-Ⅱ荧光量子点CuInSe2(CISe)，他们通过调节量子点中Se和In的掺杂比例，将其最大发射长从920 nm调节到1224 nm；当CISe采用ZnS包覆后，稳定性明显提高，且其在NIR-Ⅱ的绝对荧光量子产率能达到21.8%。值得注意的是，该量子点对微小肿瘤表现出了良好的NIR-Ⅱ荧光成像效果[如图8(e)所示]。这些NIR-Ⅱ荧光量子点的开发及其在小动物活体水平上表现出的良好的荧光成像效果，为其应用于NIR-Ⅱ荧光手术导航奠定了基础。
图 8.
图 8. 用于NIR-Ⅱ成像的量子点。(a)Ag2S 纳米探针用于脑胶质瘤[77]的NIR-Ⅱ成像和手术导航；(b)～(d)Ag2S 纳米探针用于腹膜转移瘤的NIR-Ⅱ成像和手术导航[80]；(e)NIR-Ⅱ量子点CISe用于活体小鼠肿瘤成像[81]
稀土纳米探针
稀土元素是17种特殊元素的总称，包括化学元素周期表中镧系的 15 个元素以及与镧系密切相关的钇(Y)和钪(Sc)这两种元素。稀土离子因具有独特的电子结构及丰富的能级，能产生紫外光到近红外光等各种波长的发射，展现出了良好的光学特性。其中，稀土荧光材料以其宽的荧光发射光谱、高的荧光量子效率、良好的荧光稳定性以及低的生物毒性等优点，在分析检测和生物医学成像等方面显示出了极大的应用潜能和广阔的应用前景[82-85]。一直以来，科研工作者对稀土纳米探针的研究主要集中在可见光到NIR-Ⅰ波段，但其荧光量子产率和穿透深度偏低，从而限制了其在荧光手术导航上的应用。
近年来，NIR-Ⅱ稀土纳米探针也陆续被科研工作者开发，并被成功应用到荧光手术导航领域。2018年，复旦大学张凡教授课题组[86]开发了一种稀土掺杂的下转换纳米探针(DCNPs-L1-FSHβ/ DCNPs-L2-FSHβ)，并结合化学自组装技术实现了该探针在肿瘤内的长期稳定标记，极大地提高了光学成像的信噪比，成功实现了卵巢癌腹膜转移以及淋巴结转移肿瘤在NIR-Ⅱ荧光成像引导下的精准切除，如图9(a)～(c)所示。哈尔滨工业大学陈冠英教授课题组[87]采用材料晶相和核壳结构精准调控策略，制备了一种发射波长在1525 nm、位于NIR-Ⅱb (1500～1700 nm)区域的小尺寸(7.4 nm)NaErF4稀土纳米晶，该纳米晶在小鼠体内能被快速代谢清除，在小鼠全身血管的高分辨动态NIR-Ⅱ荧光成像中展现出了良好的效果。2021年，南方医科大学方驰华教授课题组[88]联合中国科学院自动化所田捷教授课题组报道了一种新型多功能NIR-Ⅱ下转换稀土纳米探针NPs@Lips，其在808 nm激光激发下，可以同时发射三种不同谱段的荧光信号，这三个谱段分别为1000～1100 nm (NIR-Ⅱ)、1300～1350 nm (NIR-Ⅱa)和1500～1700 nm (NIR-Ⅱb)；该探针经脂质体修饰后，能快速从肝脾排出，具有良好的生物相容性；利用该探针可在术中对肠道血管进行多谱段NIR-Ⅱ荧光成像[如图9(e)所示]，以区分正常和异常血管，并可以实现小鼠淋巴结的精准定位和NIR-Ⅱ荧光引导下的淋巴结切除。虽然NIR-Ⅱ稀土纳米探针在小动物活体荧光手术导航上的应用上具有良好的效果，但稀土元素的体内代谢途径和生物安全性还缺乏系统的研究数据。进一步的代谢途径和安全性的系统研究，是其临床转化的基础。
图 9.
图 9. 稀土纳米探针用于NIR-Ⅱ成像。(a)～(b)DCNPs-L1-FSHβ/ DCNPs-L2-FSHβ在卵巢癌腹腔转移瘤NIR-Ⅱ成像中的应用[86]；(c)DCNPs-L1-FSHβ/ DCNPs-L2-FSHβ在手术导航中的应用效果展示[86]；(d)NPs@Lips用于肠道NIR-Ⅱb成像[88]；(e)NPs@Lips用于术中肠道血管多谱段成像[88]
单壁碳纳米管
单壁碳纳米管(SWNTs)是一种由单层石墨卷成的柱状无缝管，其直径为0.7～2 nm。SWNTs具有长径比大、结构缺陷小、端部曲率半径小等特点，这些特点使其表现出了良好的光学性能；其荧光发射大多位于近红外区域，并且具有光稳定性、无光漂白等优点，这使得其在NIR-Ⅱ荧光成像和荧光手术导航领域展现出了巨大的应用潜力。2009年，斯坦福大学戴宏杰教授团队[89]首先发现SWNTs可发射NIR-Ⅱ荧光，并通过对其表面进行磷脂-聚乙二醇( PL-PEG) 修饰提高了它的水溶性和生物相容性，然后成功地将SWNTs用于NIR-Ⅱ小鼠活体荧光成像。2014年，他们团队进一步利用SWNTs在1300～1400 nm的固有发射，在不开颅的情况下，实现了脑穿透深度>2 mm、空间分辨率达10 μm的无创脑血管NIR-Ⅱ荧光成像[90]。随后，他们团队还研发了一种荧光亮度显著增强的半导体型 SWNTs，其在 808 nm 激光激发下的发射波长可以达到1500～1700 nm，同时他们成功地将该SWNTs用于活体小鼠毛细血管和肿瘤的NIR-Ⅱ荧光成像[91]。SWNTs良好的NIR-Ⅱ荧光成像效果为其在手术导航方面的应用奠定了基础。
荧光手术导航探针的靶向修饰
目前，ICG已被广泛应用于临床荧光手术导航。但是，ICG是基于肿瘤组织与正常组织对其代谢的差异进行术中成像的，从而导致其在多数肿瘤组织中无法有效富集，使其术中成像的信噪比较低，最终影响术中成像和手术导航的效果。因此，科研工作者致力于与临床医生紧密合作，基于受体介导的特异靶向原理开发用于手术导航的新型靶向荧光探针。肿瘤细胞表面通常会表达一系列特异的受体，这些受体在肿瘤的生长中起着关键作用。因此，将这些受体作为肿瘤成像的靶点可以提高成像特异性。这类靶点的配体主要包括抗体、多肽和小分子化合物等。武汉大学洪学传教授团队[92]将靶向乳腺癌细胞表面核仁素的靶向多肽 F3 与 NIR-Ⅱ荧光探针CH1055偶联，获得了特异靶向乳腺癌的NIR-Ⅱ荧光探针CH1055-F3；该探针可以对移植和原发性乳腺癌模型进行特异的NIR-Ⅱ荧光成像，并成功引导了小鼠自发乳腺癌的精准手术切除。中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所王强斌教授团队[80]构建了一种RGD多肽偶联的Ag2S量子点探针APP-Ag2S-RGD。在构建的小鼠腹膜转移瘤模型中，该探针实现了微小(0.2 mm)肿瘤的精准NIR-Ⅱ荧光成像和检出；同时，在NIR-Ⅱ荧光成像引导下，该团队利用该探针实现了腹膜转移瘤的精准手术切除。
目前，也有部分受体介导的肿瘤特异靶向配体修饰的荧光探针进入了临床试验阶段。肿瘤表皮生长因子受体( EGFR) 是一种跨膜糖蛋白，具有配体诱导的酪氨酸蛋白激酶活性，在胃癌、乳腺癌、膀胱癌和头颈部鳞癌中都会过表达。荷兰格罗宁根大学Nagengast教授团队[93]将能够特异结合EGFR的帕尼单抗和西妥昔单抗与IRDye800CW荧光探针偶联，制备了肿瘤特异靶向的荧光探针。目前，该探针正在头颈癌( NCT01987375、NCT02415881)荧光手术导航中进行临床评估，期望早日获得阳性结果。此外，以血管生成因子为靶点的贝伐珠单抗偶联的IRDye800CW荧光手术导航探针，在乳腺癌和结直肠癌( NCT01508572、NCT02583568、NCT01691391)上的临床试验也在陆续开展中[94-95]。这些靶向设计和修饰策略，可以进一步提高荧光手术导航探针的肿瘤靶向特异性，进而提高手术导航的精准性和手术切除的彻底性，为荧光手术导航的进一步临床推广和应用提供支撑。
结束语
外科手术中手术边界的精准定位、微小病灶的发现、手术路径的规划等，对于提高手术的精准度、安全性及彻底性至关重要。术中实时荧光手术导航为精准外科提供了新工具，使临床医生可以在术中更加精准地区分病灶边界、识别残余和微小病灶、发现重要的管道与神经结构，进而提高手术的安全性和彻底性，保障病人的预后和远期生存。目前，已在临床上应用的NIR-Ⅰ荧光手术导航技术，极大地提高了外科医生手术的精准性，但也仍面临着穿透深度小、背景信号强、信噪比低、无病灶特异性等一系列瓶颈问题。近年来，NIR-Ⅱ荧光成像技术的快速发展，为解决上述瓶颈问题提供了新的机遇和手段。随着仪器科学、材料科学、化学与光学等多个学科的交叉融合，科研人员已经研制出了一系列NIR-Ⅱ荧光手术导航设备和分子探针。对于这些设备和探针的临床转化，构建一致性高、与人体肿瘤发生发展背景高度相近的动物模型是目前面临的重要瓶颈问题之一。此外，探针的长研发周期和低收益导致的投入不足也是目前遇到的瓶颈问题。因此，进一步推动NIR-Ⅱ荧光手术导航的临床转化需要企业、医院、临床医生和基础研究人员的共同参与。目前，一些临床前研究已经显示出良好的临床前景，为进一步推动NIR-Ⅱ荧光手术导航的转化应用奠定了基础，未来必将为精准外科手术时代的来临提供强有力的保障。
作者 韦族武 杨森 吴名 刘小龙 *
作者单位 福建医科大学孟超肝胆医院，福建 福州 350025
⭐️ ⭐️ ⭐️ ⭐️ ⭐️
公司简介：沈阳莫德医药科技有限公司，由行业资深人士组成研发团队，专业研发制造近红外二区小动物活体荧光成像系统，有需求随时沟通，欢迎合作。
近红外二区小动物活体荧光成像系统-沈阳莫德医药
别名：
NIR-II红外相机，NIR-II红外制冷相机，NIR-II红外低温相机，
NIR-II红外成像，NIR-II红外制冷成像，NIR-II红外低温成像，
NIR-II近红外成像相机，NIR-II近红外制冷成像相机，NIR-II近红外低温成像相机
NIR-II近红外科研成像相机，NIR-II近红外科研制冷成像相机，NIR-II近红外科研低温成像相机，
NIR-II近红外二区荧光成像相机，NIR-II近红外二区荧光制冷成像相机，NIR-II近红外二区荧光低温成像相机，
相机部分：
1、InGaAs 成像模块采用TEC电制冷方式，芯片工作温度达到-60℃或更低，且芯片工作温度可调；
2、InGaAs成像模块有效像素数量不少于640 x 512，每个像元尺寸不小于15微米；
3、InGaAs成像模块在900-1700nm具有高灵敏度，量子效率不低于70%；
4、对于微弱信号可实现不短于99秒的连续曝光；
5、能够实现近红外二区与彩色可见光的实时同步成像，且精确融合图像能够实时展示。
6、近红外二区成像具备过曝光预警功能。成像窗宽窗位可手动自由调节。且具备灰度图像自动增强功能。
7、可见光成像部分具备自动增益，自动曝光，自动白平衡功能，能够自动进行伽马矫正。融合算法先进，用户可以根据需求确定近红外与可见光融合的有效阈值。
8、红外图像、可见光图像和二者融合图像可以同时显示。拍照和录像数据可一键采集，且拍照和录像保存后可再次进行后续数据分析并不失融合。
9、成像参数与激光激发参数能够自动保存。
激光部分：
1、荧光激发光源采用两种波长激光光源（808nm, 980 nm），功率可调且总功率≥20瓦；
2、每种荧光激发光源各采用两根液芯匀光光纤，分布两侧，保证无死角照射。
3、每根光纤末端配备准直器，可调整荧光激发光的均匀照射。
4、可通过系统软件实现激光控制。
5、激光参数自动保存在成像参数中。
暗室及控制系统：
1、标配软件具备成像参数设置功能，如曝光时间、增益、相机工作温度、内外触发等，具备红外成像窗宽/窗位手动和自动调节功能；
2、可通过软件去除背景，实现成像的平场校正等功能；
3、能够实现100μs寿命材料的荧光寿命成像；
4、可同时装载至少5个发射光滤片，标配滤片数量不少于4个；
5、具备荧光寿命成像专用软件模块，可通过软件调节激发光照明时间、相机曝光时间和激发光与相机曝光间隔时间，具有延时成像能力；
6、寿命图像与材料单光子寿命分析结果误差在10μs以内；
7、具备5通道以上小动物气体麻醉功能；
8、能够实现小鼠全身成像和局部成像，视野范围可调，最大视野范围不小于10cm x 8cm；
9、动物载物台可电控升降，行程不小于50cm；
10、动物载物台具有加温保暖功能；
应用：
适合从事生物学、医学、天文学等科研工作者，特别适用于生物医学荧光成像、材料学荧光成像、荧光偏振成像、荧光寿命成像、天文成像和激光光斑分析等多种科研领域及军事、高端安防等应用领域。
⭐️ ⭐️ ⭐️ ⭐️ ⭐️